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消臌软坚丸对肝硬化大鼠肝组织病理学和表皮生长因子的影响

发布时间:2016/5/28 9:22:42 点击数: 文章来源:不详


    摘要:目的 观察消臌软坚丸对肝硬化大鼠肝组织病理学和表皮生长因子(EGF)的影响。方法  采用四氯化碳复合因素造模法复制肝硬化大鼠模型,随机分组处理如下:正常对照组和模型对照组灌服生理盐水,消臌软坚丸低剂量组、高剂量组每日分别灌胃消臌软坚丸混悬液1.6g/Kg体重和3.2g/Kg体重,阳性药对照组每日灌胃复方鳖甲软肝片混悬液0.6g/Kg体重,共4周。光镜下观察肝硬化大鼠肝组织病理形态学变化;并测定血清和肝组织EGF含量。结果  与正常组比较,模型组大鼠肝间质广泛纤维组织增生,将正常肝小叶分割成大小不等的肝细胞团(即假小叶形成),血清和肝组织EGF含量明显升高(P<0.01)。与模型组比较,高、低剂量组和对照组肝小叶结构亦受损,少量纤维组织增生,但未见形成间隔。血清和肝组织EGF含量明显下降(P<0.05或P<0.01)。其中高剂量组与对照组比较有显著性差异(P<0.05)。结论  消臌软坚丸能显著改善肝硬化大鼠的肝脏病理组织学损害,同时可降低血清和肝组织EGF水平,具有显著的抗肝脏纤维化,阻断肝硬化进程的作用,对腹水的产生与消退也产生积极的影响。

    关键词:消臌软坚丸;肝硬化;病理形态学;表皮生长因子

    肝硬化是临床常见的慢性进行性肝脏疾病,是由一种或多种病因长期或反复作用造成的弥散性肝脏损害,肝硬化腹水是肝硬化门脉高压征的主要临床表现 。在肝硬化性疾病中,EGF表达上调是一主要特征,它除了刺激肝细胞和胆管上皮细胞增生外,还具有促进HSC分裂增生的能力。消臌软坚丸是我院治疗肝硬化腹水的制剂,临床研究显示对腹水具有良好效果[1]。为了进一步阐明其作用机理,本实验采用复合因素造模法复制肝硬化大鼠模型,然后给予药物治疗,以观察消臌软坚丸对肝硬化大鼠肝组织病理学清和表皮生长因子(EGF)的影,以揭示其延缓肝硬化进程,治疗肝硬化腹水的作用机理。

材 料 与 方 法

    1 材料

    1.1 实验动物

    健康SD大鼠60只,体重(180±20)g,雌雄各半,由河南安阳华兴实验动物养殖场提供,动物合格证号:SCXK(鄂)2004-0007。

    1.2 实验用药 

    消臌软坚丸由河北中医肝病医院制剂室制备(该院自拟方,由黄芪30g、车前子30g、葶苈子15g、沉香6g、鳖甲30g等组成,课题组监制)。实验时用蒸馏水将其配制成所需浓度的混悬液。
    复方鳖甲软肝片(阳性药对照组):由内蒙古福瑞制药有限责任公司提供,国药准字(2005)Z-71号。实验时用蒸馏水将其配制成所需浓度的混悬液。

 主要试剂
    表皮生长因子(EGF)试剂盒(批号:20051202),购自北京中生生物工程高技术公司。

 主要仪器
    722型光栅分光光度计,上海第三分析仪器厂;1-15K型高速冷冻离心机,美国Sigma公司;HH-W21-600型电热恒温水箱,天津泰斯特仪器有限公司;LEICA RM2125型切片机,德国LEICA公司;TDL-5-A型离心机,上海安亭科学仪器厂。

    2 方法

    2.1 模型制备

    60只大鼠均适应性喂养1周,随机分为造模组48只和正常组12只。参照文献[2], 48只造模组大鼠首次予皮下注射40% 四氯化碳(CCl4)花生油溶液0.5ml /100 g体重,以后每周2次皮下注射0.3ml/100g,共9周。造模开始前2 周均以20% 猪油、0.5%胆固醇、79.5%玉米面混合饲料(由河北医科大学动物实验中心加工)喂养,第 3~9 周以0.5%胆固醇和 99.5% 玉米面混合饲料(由河北医科大学动物实验中心加工)喂养。整个造模期间以 30%乙醇作为饮料让大鼠自由饮用。正常组则以正常饲料和纯净水喂养。实验9周末确认造模成功后予以分组治疗。

    2.2 分组与治疗 

    正常组随机抽取9只大鼠,将造模成功大鼠随机分为4组,每组随机抽取9 只,雌雄各半。给药情况:(1)正常对照组(简称“正常组”):灌服生理盐水10ml/Kg体重,每日1次;(2)模型对照组(简称“模型组”): 灌服生理盐水10ml/Kg体重,每日1次;(3)消臌软坚丸低剂量组(简称“低剂量组”,药量相当于临床成人用量的7.5倍):每日用药剂量为1.6g/Kg体重,每日1次灌胃;(4)消臌软坚丸高剂量组(简称“高剂量组”,药量相当于临床成人用量的15倍):每日用药剂量为3.2g/Kg体重,每日1次灌胃;(5)阳性药对照组(简称“对照组”): 用复方鳖甲软肝片的混悬液灌胃。用药剂量为0.6g/Kg体重(药量相当于临床成人用量的15倍),每日1次灌胃,每次用药体积均按1ml/100g体重计算,共4周。

    2.3 标本制备 

    治疗4周末,于最后一次给药禁食12h后用10%水合氯醛(0.2ml/kg)麻醉大鼠,腹部正中切口,腹主动脉取血,立即以4℃ 3500r/min离心5min,分离血清,密封,-20℃冻存待检;大鼠取血后,迅速剖取肝脏,并在肝脏最大叶距边缘约0.5cm处取1cm×1cm×1cm大小组织块,置于4%多聚甲醛溶液固定24h,逐级酒精脱水、透明、浸蜡、包埋、切片,采用HE染色法,光镜下观察肝硬化大鼠肝组织病理形态学变化;剩余肝组织匀浆,离心提取上清,-20℃冻存待检。分别依据试剂盒要求测定血清和肝组织EGF含量。

    2.4 统计学处理

    数据采用均数+标准差(x ±s)表示,运用SPSS for windows 11.5统计软件,用方差分析、Student- Newman-Keul检验。显著性差异水平以0.05、0.01为标准。

结    果

    1 各组大鼠病理形态学的变化

    正常组大鼠肝脏柔软,红润,被膜光滑。肝组织结构完整、清晰,肝小叶结构正常,肝细胞排列规则成索状,在中央静脉周围呈放射状分布。肝血窦结构清晰,无异常改变。肝细胞呈多边形,胞浆均匀,细胞核形态正常。模型组大鼠肝脏体积有所增大,质地变硬,色黯红,切面可见多个小结节。肝小叶正常结构消失,间质内弥漫性淋巴细胞浸润。肝细胞体积明显增大,局部肝细胞出现严重的脂肪变性,可见到再生的肝细胞(双核)。肝间质广泛纤维组织增生,将正常肝小叶分割成大小不等的肝细胞团(即假小叶形成)。高、低剂量组和对照组大鼠肝脏体积、质地、色泽与模型组比较均明显改善,接近正常组。肝小叶结构受损,少数肝细胞气泡样变性但仅偶见坏死细胞,较少炎性细胞浸润,少量纤维组织增生,但未见形成间隔。

    2 各组大鼠血清和肝组织EGF含量变化 见表1。

    与正常组比较,模型组大鼠血清和肝组织EGF含量明显升高(P<0.01)。与模型组比较,高、低剂量组和对照组血清和肝组织EGF含量明显下降(P<0.05或P<0.01)。其中高剂量组与对照组比较有显著性差异(P<0.05)。

表2  各组大鼠血清和肝组织EGF含量变化(x±s)

组别

n

血清

匀浆

正常组

9

0.758±0.271△△

0.536±0.123△△

模型组

9

1.375±0.273

1.046±0.309

对照组

9

1.089±0.152△△

0.786±0.234

高剂量组

9

0.862±0.157△△※

0.561±0.178△△※

低剂量组

9

0.945±0.212△△

0.768±0.148△△

注:与模型组比较,△P〈0.05,△△P〈0.01;与对照组比较,※P〈0.05

讨    论

    肝硬化腹水是临床上常见的危重病证。多由感受湿热疫毒或酒毒虫蛊,复因酒食不节,情志失畅,而致肝脾失调、气滞血瘀、水液停聚,其中尤以脾虚血瘀,水湿内停为要,故消臌软坚丸突出益气健脾,活血利水,方中鳖甲咸寒入肝脾血分,软坚散结,穿山甲咸能软坚,性善走窜,可透达经络直达病所,二者合用共为通络软坚、消癥化积之主药,丹参“专入血分”,泽兰芳香悦脾、疏利悦肝,黄芪益气健脾,“脾健则积自消”,配白术培固中州以制水之中源;葶苈子为肺家气药,宣肺利水,以开水之上源;沉香性温气香,降气平逆,兼纳肾气以理下焦;厚朴苦能下气,辛能散结,温能燥湿,兼理中下二焦之气滞,大腹皮下气宽中,行水消肿;佐以大剂甘淡渗利之品如茯苓皮、车前子、泽泻等以引湿邪外走。

    EGF在肝脏中最重要的作用是促进上皮组织增殖和分化,可促进胚胎肝小叶、肝内、外胆管的形成、生长和发育。肝脏有很强的转运并代谢EGF的能力,肝细胞通过特异性受体介导的胞吞作用摄入门脉血中的EGF,摄入的EGF以降解或完全的形式分泌到胆汁中。再生肝脏EGF受体分布与正常肝脏明显不同,再生肝脏细胞核EGF受体明显增加[3]。肝硬化常伴有炎性细胞因子水平的升高[4],循环中出现多种自身抗体,可刺激EGF含量增加,促使肝组织结构破坏和纤维化的形成。何浩明等[5]测定肝硬化患者无论有无腹水其血中EGF含量均非常显著地高于正常人,尤以肝硬化腹水组为甚(p<0.001)。

    本实验结果表明,伴随着大鼠肝组织病理形态学变化,模型组大鼠血清和肝组织EGF含量较正常组有明显的升高,分析其原因,可能是EGF可促进成熟肝实质细胞非实质细胞的胶原合成,特别是通过调节贮脂细胞增生环节,刺激DNA的合成,加速肝纤维化、肝硬化的形成[6,7]。经过用药治疗后,消臌软坚丸高、低剂量组和对照组均能明显降低EGF含量,且高剂量组作用较对照组显著。

    综上所述,消臌软坚丸能显著改善肝硬化大鼠的肝脏病理组织学损害,具有促进肝脏的修复与再生,抑制胶原纤维合成、沉积,减轻肝损伤的作用,同时通过降低血清和肝组织EGF含量发挥抗肝脏纤维化,阻断肝硬化进程的作用,对腹水的产生与消退也产生积极的影响。

参 考 文 献

    1 戚忠玺,耿兰书,贡桂英,等.消臌软坚丸治疗肝炎肝硬化腹水88例的临床观察. 中医杂志,2004,45(5):347-349
    2 韩德五,马学慧,赵元昌.肝硬化动物模型的研究.山西医药杂志,1979,(4):1-5.
    3 邬善敏,戴植本.肝硬化患者肝脏表皮生长因子受体的表达及其意义.中国组织化学与细胞化学杂志,1997,2:166.
    4 杨牧祥,王少贤,张一昕,等.柔肝消癥饮对肝硬化大鼠血清和肝组织IL-1β和IL-6含量的影响. 中西医结合肝病杂志,2007,17(2):100-101,104
    5 何浩明,冯岚,田小平,等.肝硬化患者血清表皮生长因子含量的变化及意义.放射免疫学杂志,2000,13(1):57-58
    6 陈图兴,孙宏训1用流式细胞计检测表皮生长因子对肝细胞DNA合成的刺激作用1临床肝胆病杂志,1991,7(4):178-1801
    7 Marti V.Biological effects of epiderral grouth facter,with emphasis on the gastrointestinal tract and liver.anupdate,Hepatology,1989,9:126-1381

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