欢迎访问河北中医肝病医院!网络预约无需排队

联系电话:400-8769-120 手机版

  • TEL:400-8769-120
  • 医院传真:0311-88786584
您现在的位置: 河北中医肝病医院 > 肝病医院 > 学术研究 > 正文

消臌软坚丸对肝硬化大鼠肝功能、肝纤维化指标及肝脏病理学的影响

发布时间:2016/5/28 9:22:43 点击数: 文章来源:不详

    摘要 目的:观察消臌软坚丸对肝硬化大鼠肝功能、肝纤维化和肝脏病理形态学的影响。方法  采用复合因素造模法复制肝硬化大鼠模型,以复方鳖甲软肝片为对照,观察消臌软坚丸对大鼠肝功能、肝纤维化和肝脏病理形态学的影响。结果:与正常组比较,模型组大鼠肝间质广泛纤维组织增生,将正常肝小叶分割成大小不等的肝细胞团(即假小叶形成),血清血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)和总胆红素(Tbil)、Ⅲ型前胶原(PCⅢ)、透明质酸(HA)、Ⅳ型胶原(Ⅳ-C)、层粘连蛋白(LN)含量明显升高,白蛋白/总蛋白(A/G)比例明显降低(P<0.01)。与模型组比较,高、低剂量组和对照组肝小叶结构亦受损,少量纤维组织增生,但未见形成间隔。血清ALT、AST活性和Tbil、PCⅢ、HA、Ⅳ-C、LN含量明显下降,A/G比例明显升高(P<0.05或P<0.01)。其中高剂量组ALT、AST活性和Tbil含量、Ⅳ-C含量、A/G比例与对照组比较有显著性差异(P<0.05或P<0.01)。结论:消臌软坚丸能显著改善肝硬化大鼠的肝脏病理组织学损害,降低肝硬化大鼠血清中HA、 LN、 PCⅢ、Ⅳ-C的含量,从而减轻细胞外基质(ECM)在肝内的沉积,同时通过降低血清转氨酶活性和总胆红素水平,升高白蛋白/总蛋白比例,改善肝功能,具有显著的抗肝脏纤维化、逆转肝硬化的作用,对腹水的产生与消退也产生积极的影响。
    关键词:消臌软坚丸;肝硬化;肝功能;肝纤维化;病理形态学

    肝硬化是临床常见的慢性进行性肝脏疾病,是由一种或多种病因长期或反复作用造成的弥散性肝脏损害,肝硬化腹水是肝硬化门脉高压征的主要临床表现 。消臌软坚丸是我院治疗肝硬化腹水的制剂,临床研究显示对腹水具有良好效果[1]。为了进一步阐明其作用机理,本实验采用复合因素造模法复制肝硬化大鼠模型,然后给予药物治疗,以观察消臌软坚丸对肝硬化大鼠肝功能、肝纤维化指标和肝脏病理形态学的影响,以揭示其延缓肝硬化进程,治疗肝硬化腹水的作用机理。
    1材料与方法
    1.1动 物 
   健康SD大鼠60只,体质量(180±20)g,雌雄各半,由河南安阳华兴实验动物养殖场提供,动物合格证号:SCXK(豫)2004-0007。
    1.2 药物与试剂
   消臌软坚丸,为河北中医肝病医院自拟方,由黄芪30g、车前子30g、葶苈子15g、沉香6g、鳖甲30g等组成,由课题组监制,河北中医肝病医院制剂室制备,批号20041220,。实验时用蒸馏水将其配制成所需浓度的混悬液。复方鳖甲软肝片,内蒙古福瑞制药有限责任公司产品,国药准字(2005)Z-71号,批号:20030710。实验时用蒸馏水将其配制成所需浓度的混悬液。
   丙氨酸氨基转移酶(ALT)试剂盒(批号20051202)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)试剂盒(批号20051202),均购自南京建成生物工程研究所;总胆红素(Tbil)试剂盒、白蛋白/总蛋白(A/ G)试剂盒(批号20051202),均购自北京中生生物工程高技术公司;Ⅲ型前胶原(PCⅢ)放免药盒(批号20051205)、Ⅳ型胶原(Ⅳ-C)放免药盒(批号20051205)、透明质酸(HA)放免药盒(批号20051205)、层粘连蛋白(LN))放免药盒(批号20051205),购自天津九鼎医学生物工程有限公司。
    1.3主要仪器
   722型光栅分光光度计,上海第三分析仪器厂产品;1-15K型高速冷冻离心机,美国Sigma公司产品;HH-W21-600型电热恒温水箱,天津泰斯特仪器有限公司产品;LEICA RM2125型切片机,德国LEICA公司产品;FJ-2021型γ射线免疫计数器,国营二六二厂产品;TDL-5-A型离心机,上海安亭科学仪器厂产品。
    1.4 模型的建立
   60只大鼠均适应性喂养1w,随机分为造模组48只和正常组12只。参照文献[2], 48只造模组大鼠首次予皮下注射40% 四氯化碳(CCl4)花生油溶液0.5 mL /100 g体重,以后每周2次皮下注射0.3 mL/100g,共9 w。造模开始前2 w均以20% 猪油、0.5%胆固醇、79.5%玉米面混合饲料(由河北医科大学动物实验中心加工)喂养,第 3~9 周以0.5%胆固醇和 99.5% 玉米面混合饲料(由河北医科大学动物实验中心加工)喂养。整个造模期间以 30%乙醇作为饮料让大鼠自由饮用。正常组则以正常饲料和纯净水喂养。实验9 w末确认造模成功后予以分组治疗。
    1.5 分组与治疗  
   正常组随机抽取9只大鼠,将造模成功大鼠随机分为4组,每组随机抽取9 只,雌雄各半。给药情况:①正常对照组:灌服生理盐水10 mL/kg体重,1d 1次;②模型对照组: 灌服生理盐水10 mL/kg体重,1d 1次;③消臌软坚丸低剂量组(简称低剂量组),每日用药剂量为1.6g/Kg体重,每日1次灌胃,药量相当于临床成人用量的7.5倍,;④消臌软坚丸高剂量组(简称高剂量组):每日用药剂量为3.2g/Kg体重,每日1次灌胃,药量相当于临床成人用量的15倍;⑤阳性药对照组: 用复方鳖甲软肝片的混悬液灌胃,用药剂量为0.6 g/kg体重, 每日1次灌胃,药量相当于临床成人用量的15倍,每次用药体积均按1 mL/100g体重计算,共4 w。
    1.6 标本制备 
    1.6.1 血清样本的制备  
   治疗4w末,于最后1次给药禁食12 h后用10%水合氯醛(0.2 mL/kg)麻醉大鼠,腹部正中切口,腹主动脉取血,立即以4℃ 3500 r/min离心5min,分离血清,密封,-20℃冻存待检。检测时将冻存的血清放置于37oC恒温水浴箱解冻,分别依据试剂盒要求采用比色法,测定ALT、AST、Alb、TP。Ⅳ-C、LN采用液相平衡竞争放射免疫分析法,HA、PCⅢ采用竞争法。
    1.6.2 肝组织病理切片的制备  
   大鼠取血后,迅速剖取肝脏,并在肝脏最大叶距边缘约0.5 cm处取1cm×1cm×1cm大小组织块,置于4%多聚甲醛溶液固定24 h,逐级酒精脱水、透明、浸蜡、包埋、切片,采用HE染色法,光镜下观察肝硬化大鼠肝组织病理形态学变化
    1.7 统计学方法
   数据采用均数+标准差(x ±s)表示,运用SPSS  11.5统计软件,用方差分析、Student- Newman-Keul检验。显著性差异水平以0.05、0.01为标准。
    2 结 果
    2. 1各组大鼠病理形态学的变化
正常对照组大鼠肝脏柔软,红润,被膜光滑。肝组织结构完整、清晰,肝小叶结构正常,肝细胞排列规则成索状,在中央静脉周围呈放射状分布。肝血窦结构清晰,无异常改变。肝细胞呈多边形,胞浆均匀,细胞核形态正常(见图1)。模型对照组大鼠肝脏体积有所增大,质地变硬,色黯红,切面可见多个小结节。肝小叶正常结构消失,间质内弥漫性淋巴细胞浸润。肝细胞体积明显增大,局部肝细胞出现严重的脂肪变性,可见到再生的肝细胞(双核)。肝间质广泛纤维组织增生,将正常肝小叶分割成大小不等的肝细胞团(即假小叶形成)(见图2)。高剂量组(见图3)、低剂量组(见图4)和阳性药对照组(见图5)大鼠肝脏体积、质地、色泽与模型对照组比较均有明显改善,接近正常组;肝小叶结构受损,少数肝细胞气泡样变性但仅偶见坏死细胞,较少炎性细胞浸润,少量纤维组织增生,但未见形成间隔。
    2.2  各组大鼠血清ALT、AST活性和Alb、TP含量的变化
与正常对照组比较,模型对照组大鼠血清ALT、AST活性和Tbil含量明显升高,A/G比例明显降低,差别有统计学意义(P<0.01)。与模型组比较,高、低剂量组和对照组血清ALT、AST活性和Tbil含量明显下降,A/G比例明显升高,差别有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。其中高剂量组ALT、AST活性和Tbil含量、A/G比例与阳性药对照组比较差别有统计学意义有(P<0.05或P<0.01)。见表1。
    表1 各组大鼠血清ALT、AST活性和Tbil、A/G含量变化
________________________________________________________________________________________
    组别     n     ALT(U)         AST(U)         Tbil(g/L)          A/G
________________________________________________________________________________________
正常对照组   9 21.22±5.85**   34.78±2.54**    9.229±2.734**      1.298±0.275**
模型对照组   9 34.67±7.09     45.11±5.75     18.914±4.045      0.587±0.142
阳性药对照组 9 28.00±4.21*    39.44±4.61*     15.425±2.786*     0.906±0.128*
高剂量组     9 21.56±5.55**△ 33.33±6.89**△  10.809±3.539**△△ 1.191±0.540**△
低剂量组     9 27.00±7.21*    36.33±5.43**    13.188±3.727**    0.936±0.160*
_________________________________________________________________________________________

注:与模型对照组对比,*P〈0.05,**P〈0.01;与阳性药对照组对比,P〈0.05,△△P〈0.01。
    2.3  各组大鼠血清肝纤维化指标含量的变化
    与正常对照组比较,模型对照组大鼠血清PCⅢ、HA 、Ⅳ-C 、LN 含量均明显升高,差别有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。与模型对照组比较,高、低剂量组和阳性药对照组血清PCⅢ、HA 、Ⅳ-C 、LN 含量明显下降,差别亦有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。其中高剂量组Ⅳ-C含量与阳性药对照组比较差别有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。见表2。

    表2  各组大鼠血清肝纤维化指标含量的变化
_____________________________________________________________________________________
    组别     n   PCⅢ(μg/L)    HA(ng/mL)      Ⅳ-C(μg/L)    LN(μg/L)
_____________________________________________________________________________________
正常对照组   9   18.24±5.49**   74.78±13.80**    5.55±2.12*     41.10±8.56*
模型对照组   9   32.31±5.18     123.10±21.42    17.23±3.06     53.22±7.92
阳性药对照组 9   25.55±3.32**    94.30±19.23**   12.24±2.32*    42.94±8.65*
高剂量组     9   22.73±3.58**    83.73±18.84**   6.15±3.02*△   40.16±8.69*
低剂量组     9   23.87±3.84**    95.04±17.27**   11.34±2.42*    48.05±5.24
______________________________________________________________________________________
注:与模型对照组对比,*P〈0.05,**P〈0.01;与阳性药对照组对比,P〈0.05。

    3讨    论

    肝硬化腹水是临床上常见的危重病证。其多由感受湿热疫毒或酒毒虫蛊,复因酒食不节,情志失畅,而致肝脾失调、气滞血瘀、水液停聚,其中尤以脾虚血瘀、水湿内停为要,故消臌软坚丸突显益气健脾、活血利水之功。方中鳖甲咸寒入肝脾血分,软坚散结;穿山甲咸能软坚,性善走窜,可透达经络直达病所;二者合用,共为通络软坚、消癥化积之主药。丹参“专入血分”;泽兰芳香悦脾、疏利悦肝;黄芪益气健脾,“脾健则积自消”,配白术培固中州以制水之中源;葶苈子为肺家气药,宣肺利水,以开水之上源;沉香性温气香,降气平逆,兼纳肾气以理下焦;厚朴苦能下气,辛能散结,温能燥湿,兼理中下二焦之气滞;大腹皮下气宽中,行水消肿,佐以大剂甘淡渗利之品如茯苓皮、车前子、泽泻等以引湿邪外走。
    转氨酶是反映肝损伤出现最早、最敏感的指标,对肝病诊断具有重要意义。其中AST变化反映肝细胞线粒体损伤程度,ALT变化反映肝细胞膜损伤程度;总蛋白和白蛋白的变化反映肝细胞合成蛋白能力;Tbil反映肝脏的代谢能力。肝硬化时,肝功能受损,AST和ALT活性均升高,蛋白合成能力降低,一般白蛋白降低程度与肝脏受损程度相平行[3]。慢性和重型肝炎及肝硬化患者白蛋白浓度降低,同时球蛋白产生增加,A/G比值倒置。本实验结果表明模型对照组大鼠血清ALT、AST活性和Tbil含量明显升高,A/G比例明显降低。说明伴随着肝硬化的形成,大鼠血清转氨酶水平出现异常改变,蛋白合成能力降低,胆红素代谢紊乱。经用药治疗后,各治疗组血清ALT、AST活性和Tbil含量明显下降,A/G比例明显升高,说明治疗用药后可明显降低肝硬化大鼠血清转氨酶水平和Tbil含量,升高A/G比例,具有改善肝功能,调节蛋白合成和胆红素代谢,保护肝脏的作用,并且消臌软坚丸的疗效优于复方鳖甲软肝片。
    肝纤维化主要病理特点是胶原蛋白、蛋白多糖及粘连蛋白等多种细胞外基质(ECM)在肝内的过度沉积。PCIII和IV -C、HA、LN分别是上述三类细胞外基质的代表,而且是反映肝纤维化、肝硬化的血清学指标,联合检测更具有意义[4-5]。联合检测血清HA、PCIII、Ⅳ-C、LN水平或动态观察是判断慢性肝病患者有无肝纤维化组织增生敏感而可靠的指标,有助于提高肝纤维化、肝硬化诊断准确性,并对判断肝病治疗效果有积极的意义[6-9]。本实验结果表明,消臌软坚丸能降低肝硬化大鼠血清中HA、LN、PCⅢ、Ⅳ-C的含量,从而减轻细胞外基质(ECM)在肝内的沉积。
    综上所述,消臌软坚丸能显著改善肝硬化大鼠的肝脏病理组织学损害,具有促进肝脏的修复与再生,抑制胶原纤维合成、沉积,减轻肝损伤的作用,同时通过降低血清转氨酶活性和总胆红素水平,升高白蛋白/总蛋白比例,改善肝功能,具有显著的抗肝脏纤维化,逆转肝硬化的作用,对腹水的产生与消退也产生积极的影响。

参考文献(略)

    
 图1:正常对照组大鼠肝组织(HE  ×100)

   
图2:模型对照组大鼠肝组织(HE  ×100)
 

 
图3:高剂量组大鼠肝组织(HE  ×100)

 
图4:低剂量组大鼠肝组织(HE  ×100)

 
图5:阳性药对照组大鼠肝组织(HE  ×100)

 

  • 上一个文章:
  • 下一个文章:
  • 猜您还想了解

  • 我院推出肝病大型公益救助活动
  • 我院引进飞利浦BV Pulsera新型移动式…
  • 1月13日-14日 王宪波教授来河北中医肝…
  • 1月8日-14日 专家出诊表
  • 北京名医郭朋来我院会诊
  • >>在线预约 >>专家挂号

    选择河北中医肝病医院五大理由

    >>了解详细
    理由一    肝病专科医院,专业治肝病 理由二    医保定点医院 理由三    治肝费用低,新农合定点医院 理由四    国家重点肝病专科医院 理由五    中西医结合护肝保肝治肝病效果好

    医院环境

    • 门诊大厅
    • 住院走廊
    • 医院花园
    • 门诊大楼
    • 导医台
    • 住院部

    图文推荐

    我院推出肝病大型公益救助…
     
           河北省肝病防治春雨工... 【详情】
    我院引进飞利浦BV Pulsera…
     
       我院引进飞利浦BV Endura移动式C型臂血管... 【详情】
    1月8日-14日 专家出诊表
     
       河北省肝病防治春雨工程办公室联合河北中医肝病医院... 【详情】
    来院公交线路: