消臌软坚丸对肝硬化大鼠肝组织病理学和表皮生长因子的影响

    摘要：目的 观察消臌软坚丸对肝硬化大鼠肝组织病理学和表皮生长因子（EGF）的影响。方法  采用四氯化碳复合因素造模法复制肝硬化大鼠模型，随机分组处理如下：正常对照组和模型对照组灌服生理盐水，消臌软坚丸低剂量组、高剂量组每日分别灌胃消臌软坚丸混悬液1.6g/Kg体重和3.2g/Kg体重，阳性药对照组每日灌胃复方鳖甲软肝片混悬液0.6g/Kg体重，共4周。光镜下观察肝硬化大鼠肝组织病理形态学变化；并测定血清和肝组织EGF含量。结果  与正常组比较，模型组大鼠肝间质广泛纤维组织增生，将正常肝小叶分割成大小不等的肝细胞团（即假小叶形成），血清和肝组织EGF含量明显升高（P＜0.01）。与模型组比较，高、低剂量组和对照组肝小叶结构亦受损，少量纤维组织增生，但未见形成间隔。血清和肝组织EGF含量明显下降（P＜0.05或P＜0.01）。其中高剂量组与对照组比较有显著性差异（P＜0.05）。结论  消臌软坚丸能显著改善肝硬化大鼠的肝脏病理组织学损害，同时可降低血清和肝组织EGF水平，具有显著的抗肝脏纤维化，阻断肝硬化进程的作用，对腹水的产生与消退也产生积极的影响。

    关键词：消臌软坚丸；肝硬化；病理形态学；表皮生长因子

    肝硬化是临床常见的慢性进行性肝脏疾病，是由一种或多种病因长期或反复作用造成的弥散性肝脏损害，肝硬化腹水是肝硬化门脉高压征的主要临床表现 。在肝硬化性疾病中，EGF表达上调是一主要特征，它除了刺激肝细胞和胆管上皮细胞增生外，还具有促进HSC分裂增生的能力。消臌软坚丸是我院治疗肝硬化腹水的制剂，临床研究显示对腹水具有良好效果^［1］。为了进一步阐明其作用机理，本实验采用复合因素造模法复制肝硬化大鼠模型，然后给予药物治疗，以观察消臌软坚丸对肝硬化大鼠肝组织病理学清和表皮生长因子（EGF）的影，以揭示其延缓肝硬化进程，治疗肝硬化腹水的作用机理。

材 料 与 方 法

    1 材料

    1.1 实验动物

    健康SD大鼠60只，体重（180±20）g，雌雄各半，由河南安阳华兴实验动物养殖场提供，动物合格证号：SCXK（鄂）2004-0007。

    1.2 实验用药 

    消臌软坚丸由河北中医肝病医院制剂室制备（该院自拟方，由黄芪30g、车前子30g、葶苈子15g、沉香6g、鳖甲30g等组成，课题组监制）。实验时用蒸馏水将其配制成所需浓度的混悬液。
    复方鳖甲软肝片（阳性药对照组）：由内蒙古福瑞制药有限责任公司提供，国药准字（2005）Z-71号。实验时用蒸馏水将其配制成所需浓度的混悬液。

 主要试剂
    表皮生长因子（EGF）试剂盒（批号：20051202），购自北京中生生物工程高技术公司。

 主要仪器
    722型光栅分光光度计，上海第三分析仪器厂；1-15K型高速冷冻离心机，美国Sigma公司；HH-W21-600型电热恒温水箱，天津泰斯特仪器有限公司；LEICA RM2125型切片机，德国LEICA公司；TDL-5-A型离心机，上海安亭科学仪器厂。

    2 方法

    2.1 模型制备

    60只大鼠均适应性喂养1周，随机分为造模组48只和正常组12只。参照文献^[2]， 48只造模组大鼠予皮下注射40% 四氯化碳（CCl4）花生油溶液0.5ml /100 g体重，以后每周2次皮下注射0.3ml/100g，共9周。造模开始前2 周均以20% 猪油、0.5%胆固醇、79.5%玉米面混合饲料（由河北医科大学动物实验中心加工）喂养，第 3～9 周以0.5%胆固醇和 99.5% 玉米面混合饲料（由河北医科大学动物实验中心加工）喂养。整个造模期间以 30%乙醇作为饮料让大鼠自由饮用。正常组则以正常饲料和纯净水喂养。实验9周末确认造模成功后予以分组治疗。

    2.2 分组与治疗 

    正常组随机抽取9只大鼠，将造模成功大鼠随机分为4组，每组随机抽取9 只，雌雄各半。给药情况：（1）正常对照组（简称“正常组”）：灌服生理盐水10ml/Kg体重，每日1次；（2）模型对照组（简称“模型组”）： 灌服生理盐水10ml/Kg体重，每日1次；（3）消臌软坚丸低剂量组（简称“低剂量组”，药量相当于临床成人用量的7.5倍）：每日用药剂量为1.6g/Kg体重，每日1次灌胃；（4）消臌软坚丸高剂量组（简称“高剂量组”，药量相当于临床成人用量的15倍）：每日用药剂量为3.2g/Kg体重，每日1次灌胃；（5）阳性药对照组（简称“对照组”）： 用复方鳖甲软肝片的混悬液灌胃。用药剂量为0.6g/Kg体重（药量相当于临床成人用量的15倍），每日1次灌胃，每次用药体积均按1ml/100g体重计算，共4周。

    2.3 标本制备 

    治疗4周末，于后一次给药禁食12h后用10%水合氯醛（0.2ml/kg）麻醉大鼠，腹部正中切口，腹主动脉取血，立即以4℃ 3500r/min离心5min，分离血清，密封，-20℃冻存待检；大鼠取血后，迅速剖取肝脏，并在肝脏大叶距边缘约0.5cm处取1cm×1cm×1cm大小组织块，置于4%多聚甲醛溶液固定24h，逐级酒精脱水、透明、浸蜡、包埋、切片，采用HE染色法，光镜下观察肝硬化大鼠肝组织病理形态学变化；剩余肝组织匀浆，离心提取上清，-20℃冻存待检。分别依据试剂盒要求测定血清和肝组织EGF含量。

    2.4 统计学处理

    数据采用均数+标准差（x ±s）表示，运用SPSS for windows 11.5统计软件，用方差分析、Student- Newman-Keul检验。显著性差异水平以0.05、0.01为标准。

结    果

    1 各组大鼠病理形态学的变化

    正常组大鼠肝脏柔软，红润，被膜光滑。肝组织结构完整、清晰，肝小叶结构正常，肝细胞排列规则成索状，在中央静脉周围呈放射状分布。肝血窦结构清晰，无异常改变。肝细胞呈多边形，胞浆均匀，细胞核形态正常。模型组大鼠肝脏体积有所增大，质地变硬，色黯红，切面可见多个小结节。肝小叶正常结构消失，间质内弥漫性淋巴细胞浸润。肝细胞体积明显增大，局部肝细胞出现严重的脂肪变性，可见到再生的肝细胞（双核）。肝间质广泛纤维组织增生，将正常肝小叶分割成大小不等的肝细胞团（即假小叶形成）。高、低剂量组和对照组大鼠肝脏体积、质地、色泽与模型组比较均明显改善，接近正常组。肝小叶结构受损，少数肝细胞气泡样变性但仅偶见坏死细胞，较少炎性细胞浸润，少量纤维组织增生，但未见形成间隔。

    2 各组大鼠血清和肝组织EGF含量变化 见表1。

    与正常组比较，模型组大鼠血清和肝组织EGF含量明显升高（P＜0.01）。与模型组比较，高、低剂量组和对照组血清和肝组织EGF含量明显下降（P＜0.05或P＜0.01）。其中高剂量组与对照组比较有显著性差异（P＜0.05）。

表2  各组大鼠血清和肝组织EGF含量变化（x±s）

注:与模型组比较，△P〈0.05，△△P〈0.01；与对照组比较，※P〈0.05

讨    论

    肝硬化腹水是临床上常见的危重病证。多由感受湿热疫毒或酒毒虫蛊，复因酒食不节，情志失畅，而致肝脾失调、气滞血瘀、水液停聚，其中尤以脾虚血瘀，水湿内停为要，故消臌软坚丸突出益气健脾，活血利水，方中鳖甲咸寒入肝脾血分，软坚散结，穿山甲咸能软坚，性善走窜，可透达经络直达病所，二者合用共为通络软坚、消癥化积之主药，丹参“专入血分”，泽兰芳香悦脾、疏利悦肝，黄芪益气健脾，“脾健则积自消”，配白术培固中州以制水之中源；葶苈子为肺家气药，宣肺利水，以开水之上源；沉香性温气香，降气平逆，兼纳肾气以理下焦；厚朴苦能下气，辛能散结，温能燥湿，兼理中下二焦之气滞，大腹皮下气宽中，行水消肿；佐以大剂甘淡渗利之品如茯苓皮、车前子、泽泻等以引湿邪外走。

    EGF在肝脏中重要的作用是促进上皮组织增殖和分化，可促进胚胎肝小叶、肝内、外胆管的形成、生长和发育。肝脏有很强的转运并代谢EGF的能力，肝细胞通过特异性受体介导的胞吞作用摄入门脉血中的EGF，摄入的EGF以降解或的形式分泌到胆汁中。再生肝脏EGF受体分布与正常肝脏明显不同，再生肝脏细胞核EGF受体明显增加^[3]。肝硬化常伴有炎性细胞因子水平的升高^[4]，循环中出现多种自身抗体，可刺激EGF含量增加，促使肝组织结构破坏和纤维化的形成。何浩明等^[5]测定肝硬化患者无论有无腹水其血中EGF含量均非常显著地高于正常人,尤以肝硬化腹水组为甚(p<0.001)。

    本实验结果表明，伴随着大鼠肝组织病理形态学变化，模型组大鼠血清和肝组织EGF含量较正常组有明显的升高，分析其原因，可能是EGF可促进成熟肝实质细胞非实质细胞的胶原合成，特别是通过调节贮脂细胞增生环节，刺激DNA的合成，加速肝纤维化、肝硬化的形成^[6，7]。经过用药治疗后，消臌软坚丸高、低剂量组和对照组均能明显降低EGF含量，且高剂量组作用较对照组显著。

    综上所述，消臌软坚丸能显著改善肝硬化大鼠的肝脏病理组织学损害，具有促进肝脏的修复与再生，抑制胶原纤维合成、沉积，减轻肝损伤的作用，同时通过降低血清和肝组织EGF含量发挥抗肝脏纤维化，阻断肝硬化进程的作用，对腹水的产生与消退也产生积极的影响。

参 考 文 献

    1 戚忠玺，耿兰书，，等.消臌软坚丸治疗肝炎肝硬化腹水88例的临床观察. 中医杂志，2004，45（5）：347-349
    2 韩德五，马学慧，赵元昌．肝硬化动物模型的研究．山西医药杂志，1979，(4)：1-5．
    3 邬善敏,戴植本.肝硬化患者肝脏表皮生长因子受体的表达及其意义.中国组织化学与细胞化学杂志,1997,2:166.
    4 杨牧祥，王少贤，张一昕，等.柔肝消癥饮对肝硬化大鼠血清和肝组织IL-1β和IL-6含量的影响. 中西医结合肝病杂志，2007，17（2）：100-101，104
    5 何浩明，冯岚，田小平，等.肝硬化患者血清表皮生长因子含量的变化及意义.放射免疫学杂志，2000，13（1）：57-58
    6 陈图兴,孙宏训1用流式细胞计检测表皮生长因子对肝细胞DNA合成的刺激作用1临床肝胆病杂志,1991,7(4):178-1801
    7 Marti V.Biological effects of epiderral grouth facter,with emphasis on the gastrointestinal tract and liver.anupdate,Hepatology,1989,9:126-1381